高速冷冻离心机提取植物蛋白质方法

一、植物组织蛋白质提取方法

  1、根据样品重量(1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入)，准备提取液放在冰上。

  2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置(3-4小时)。

  3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

  4、提取上清液，样品制备完成。

  蛋白质提取液：300ml

  1、1Mtris-HCl(PH8)45ml

  2、甘油(Glycerol)75ml

  3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g

  这种方法针对SDS-PAGE，垂直板电泳！

  二、植物组织蛋白质提取过程

  氯醋酸—丙酮沉淀法

  1、在液氮中研磨叶片

  2、加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心(4℃8000rpm以上1小时)弃上清。

  3、加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇)，摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时)，然后真空干燥沉淀，备用。

  4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准)，可临时保存在4℃待用。

  5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。

  药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮。裂解液：2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中(终体积为5ml)，使用前再加入1M的DTT65ul/ml。

  这种方法针对双向电泳，杂质少，离子浓度小的特点！当然单向电泳也同样适用，只是电泳的条带会减少！

  三、组织：肠黏膜

  目的：WESTERNBLOT检测凋亡相关蛋白的表达

  应用TRIPURE提取蛋白质步骤：

  含蛋白质上清液中加入异丙醇：(1.5ml每1mlTRIPURE用量)

  倒转混匀，置室温10min

  离心：12000g，10min，4度，弃上清

  加入0.3M盐酸胍/95％乙醇：(2ml每1mlTRIPURE用量)

  振荡，置室温20min

  离心：7500g，5min，4度，弃上清

  重复0.3M盐酸胍/95％乙醇步2次

  沉淀中加入100％乙醇2ml

  充分振荡混匀，置室温20min

  离心：7500g，5min，4度，弃上清吹干沉淀

  1％SDS溶解沉淀

  离心：10000g，10min，4度

  取上清-20度保存(或可直接用于WESTERNBLOT)

  存在的问题：加入1％SDS后沉淀不溶解，还是很大的一块，4度离心后又多了白色沉定，SDS结晶？测浓度，含量才1mg/ml左右。

  解决：提蛋白试剂盒，另外组织大小适中，要碎，立即加2XBUFFER，然后煮5－10分钟，效果很好的。

  四、植物材料：水稻苗，叶鞘，根

  1、200毫克样品置于冰上磨碎

  2、加lysisbuffer，离心，10000rpm，4度，5min取上清

  3、重复离心5min

  lysisbuffer：ureanp-40ampholine2-mepvp-40

  五、蛋白质样品制备

  秧苗蛋白质样品的提取按Davermal等(1986)的方法进行。

  100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5ml10%三氯乙酸(丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇)，混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000r/min离心15min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，(有必要再用80％丙酮(含10mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。

  按每mg干粉加入20μl(可调)UKS液[9.5M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2%Ampholine(AmershamPharmaciaBiotechInc，pH3.5-10)，6%TritonX-100]，37℃温育30min，期间搅动几次，28度(温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰)16000r/min离心15min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。或者-70度保存

  六、植物根中蛋白质的抽取

  (1)sample,液氮研磨

  (2)装1.5mlcentrifuge用tube

  (3)加1MKH2PO4K2HPO4700ul

  (4)12000rpm,4度,10-15minite

  (5)取上层液，蛋白质就在里面